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            技術(shù)文章

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            小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA實驗說明
            更新時間:2025-04-03 點擊次數(shù):268

            檢測范圍                                                          

            25 ng/L-800 ng/L

             

            使用目的

            本試劑盒用于測定小鼠血清,血漿及相關(guān)液體樣本中腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量。

             

            實驗原理

            本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。用純化的小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入腫瘤壞死因子α(TNF-α),再與HRP標記的腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物,經(jīng)過徹-底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的腫瘤壞死因子α(TNF-α)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品中腫瘤壞死因子α(TNF-α)濃度。

             

            標本要求 

            1.標本采集后盡早進行提取,提取按相關(guān)文獻進行,提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融

            2.不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

             

            操作步驟

            1. 標準品的稀釋:本試劑盒提供原倍標準品一支,用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。

            800 ng/L

            5號標準品

            150μl的原倍標準品加入150μl標準品稀釋液

            400 ng/L

            4號標準品

            150μl的5號標準品加入150μl標準品稀釋液

            200 ng/L

            3號標準品

            150μl的4號標準品加入150μl標準品稀釋液

            100 ng/L

            2號標準品

            150μl的3號標準品加入150μl標準品稀釋液

            50 ng/L

            1號標準品

            150μl的2號標準品加入150μl標準品稀釋液

             

            2. 加樣:分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl,待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。

            3. 溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。   

            4. 配液:將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

            5. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。

            6. 加酶:每孔加入酶標試劑50μl,空白孔除外。

            7. 溫育:操作同3。

            8. 洗滌:操作同5。

            9. 顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色10分鐘.

            10. 終止:每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。

            11. 測定:以空白孔調(diào)零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

             

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