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    簡述：由于酶聯(lián)免疫(ELISA)技術(shù)具有簡便、快速、經(jīng)濟等特點而被廣泛應(yīng)用于各行業(yè)。盡管如此，在應(yīng)用過程中仍然存在著許多難點，必須嚴(yán)格控制才能保證檢測的質(zhì)量。酶聯(lián)免疫試劑盒質(zhì)量保證是一個復(fù)雜的過程，許多重要的環(huán)節(jié)都影響到檢測的質(zhì)量。

實驗室酶聯(lián)免疫技術(shù)的質(zhì)量控制(升級版)：
1. 測定模式的影響
    ELISA測定模式包括：雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法、IgM抗體捕捉法、競爭抑制法，其中競爭抑制法因受操作時差所引起的不公平競爭等因素的影響，結(jié)果重復(fù)性較差，質(zhì)量較難控制。
2. ELISA試劑的準(zhǔn)備
    不同批次的試劑在制作過程中很難保證質(zhì)量*一致，即使是通過批批檢的項目其檢測結(jié)果也存在差異，因此必須選擇和訂購長批號的試劑，并保證保存條件。
    嚴(yán)格執(zhí)行這一標(biāo)準(zhǔn)可以避免因試劑批號改變而重新建立質(zhì)控體系及重新評估試劑的復(fù)雜過程，并且能夠保證結(jié)果的穩(wěn)定性；對于效期短、使用率低的試劑，應(yīng)當(dāng)小量分裝，每次使用則取分裝部分即可，避免反復(fù)凍融造成試劑的失效。
    試劑使用前必須平衡至室溫，否則會影響檢測下限。未用完的室內(nèi)質(zhì)控品及本次不需使用的試劑應(yīng)密封并及時放回冰箱保存。
3. 操作因素對ELISA結(jié)果的影響
    目前各種形式的ELISA自動分析儀已經(jīng)進入市場，如廣泛應(yīng)用于血站系統(tǒng)的微板式全自動酶免分析儀，其試劑為開放式的，而對于其它類型的儀器，則試劑和儀器往往是配套的。但當(dāng)前大部分醫(yī)學(xué)實驗室均采用手工操作加儀器測定的方式。ELISA操作步驟復(fù)雜，操作不當(dāng)將引起較大的誤差。 
     
    ELISA測定一般遵循以下步驟：固相包被→加樣品→溫育→洗滌→加酶結(jié)合物→溫育→洗滌→加底物→溫育→顯色→終止顯色→比色
4. 灰區(qū)的設(shè)置
    通常情況下，ELISA定性實驗以“陽性”和“陰性”來報告結(jié)果，兩者間有一條分界線被稱為“陽性判斷值”(CO值)，這是定性免疫測定結(jié)果報告的依據(jù)。由于ELISA CO值的設(shè)置不能區(qū)分所有正常和異常的人群，尤其是位于CO值附近的人群，并且ELISA檢測具有以下幾個特點：檢測變異大(18%～65%)；不同試劑盒CO值存在差異；病毒感染存在窗口期；病毒變異后表達產(chǎn)物含量低以及個體差異等，因此在CO值附近存在一個臨床意義可疑的的區(qū)域被稱之為“灰區(qū)”，在國內(nèi)的傳染性病原體抗原和抗體檢測的ELISA試劑盒中均未涉及“灰區(qū)”的設(shè)置，但僅僅依靠CO值來決定感染的有無，尤其是對獻血員的篩查具有較大的風(fēng)險。因此對于檢測結(jié)果位于“灰區(qū)”的病人可采用確認(rèn)實驗或追蹤檢測的辦法加以確診。
目前“灰區(qū)”的設(shè)置有二種方式：一是CO×(1±CV)， CV為該試劑的批內(nèi)CV (一般在15-20%)；二是CO±2s，s為實驗室做室內(nèi)質(zhì)控ROC(常規(guī)條件下的變異)的標(biāo)準(zhǔn)差。
5. 標(biāo)本復(fù)查
    ELISA手工檢測過程復(fù)雜，影響因素較多，即使室內(nèi)質(zhì)控在控，也可能因孔間差異而造成結(jié)果的差異，因此加大復(fù)查力度是保證結(jié)果準(zhǔn)確性的可靠方法。
    復(fù)查方式主要有：
    ① 采用同一種試劑復(fù)查，理由是市售試劑均通過國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）認(rèn)可，嚴(yán)格按照其說明書操作，檢測結(jié)果具有法律效應(yīng)，若使用不同的試劑（非確證試驗）復(fù)查，當(dāng)結(jié)果不相符合時，則zui終結(jié)果難以判斷（免疫檢測缺乏“金標(biāo)準(zhǔn)”）。
    ② 采用國外進口試劑進行復(fù)查，其理由是盡管進口試劑并不是“金標(biāo)準(zhǔn)”，但實驗室已經(jīng)對此高度重視，并且使用了質(zhì)量較好，價格較貴的試劑，但該法對于小醫(yī)院而言則很難實施。
6. 結(jié)果判斷和報告
   ① 定性測定
    陽性判定值法：一般為陰性對照的平均A值加一個常數(shù)，試劑制備、檢測過程必須嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)化，要先計算出陽性對照A值平均數(shù)和陰性對照A值平均數(shù)。
   ② 半定量測定：結(jié)果一般以滴度表示。將標(biāo)本連續(xù)稀釋后，進行ELISA檢測，在陽性臨界值以上的zui高稀釋度即為該標(biāo)本的“滴度”。
   ③ 定量測定：即用已知量的標(biāo)準(zhǔn)品作一系列稀釋后進行ELISA測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以量或單位表示。在ELISA定量檢測中每一塊反應(yīng)板都必須繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
   ④ 結(jié)果報告：傳統(tǒng)的ELISA結(jié)果只報告“陽性”或者“陰性”，但不能解決“灰區(qū)”的問題，因此引入“可疑”的報告方式是比較合理和科學(xué)的，同時對結(jié)果做必要的說明，如“結(jié)果已經(jīng)復(fù)查，建議定期復(fù)查或定量檢測”；對于HBeAb、HBcAb檢測，由于各試劑盒CO值差異及變異系數(shù)大等因素，結(jié)果缺乏可比性，位于CO值附近的標(biāo)本復(fù)查結(jié)果陰陽性只是概率事件，另外HBcAb存在原倍和1：30檢測模式及定量檢測模式，報告結(jié)果的不一致對于臨床實驗室來說是不可回避，也是目前醫(yī)療糾紛主要集中點和“結(jié)果互認(rèn)”的zui大障礙，因此在減小室內(nèi)變異的同時必須引入陽性和弱陽性的報告方式。
     
7. 原始記錄
    ELISA檢測結(jié)果變異大，不同體系難以溯源，因結(jié)果不一致而引起的醫(yī)療糾紛逐日增多，因此ELISA檢測的原始存根必須完整而全面地保存，包括布局，原始吸光度值，檢測的陰陽結(jié)果，檢測者，試劑廠家，批號，質(zhì)控品來源及批號等。嚴(yán)禁人為修改檢測結(jié)果。
8. 室內(nèi)質(zhì)量控制
   ① 室內(nèi)質(zhì)控品：穩(wěn)定以及合適的濃度是運用一切質(zhì)控規(guī)則的前提。可選擇S/CO值減去精密度測定中得到的三倍批間CV%與該S/CO值的乘積仍大于1的質(zhì)控血清作監(jiān)測重復(fù)性的室內(nèi)質(zhì)控品用。 計算公式：S/CO（1-3CV%）=S/CO-3SD。同時選擇S/CO處于1.5左右的質(zhì)控血清以判斷每次測定時試劑盒測定下限的有效性。
   ② “即刻性”質(zhì)控：一些實驗室不是每天進行ELISA項目的檢驗，而ELSIA部分試劑盒效期短，用同一批號試劑盒連續(xù)常規(guī)測20次，難度較大。采用"即刻法"質(zhì)控統(tǒng)計方法，只需連續(xù)測3次，即可對第3次檢驗結(jié)果進行質(zhì)控。
    A. 先將測定值從小到大排列，X1zui小，Xnzui大；
    B. 計算X和s；
    C. 計算SI上限值和下限值。SI上=（Xzui小-X）/S，SI下=（Xzui大-X）/S；
    D. 對照SI表，檢查是否出控。SI上、下限≤規(guī)定值，在控； SI上或下限>規(guī)定值，失控。
   ③ Levey-Jennings質(zhì)控圖結(jié)合Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法 Levey-Jennings質(zhì)控圖以及Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法zui早應(yīng)用于生化檢測的質(zhì)量控制，在ELISA檢測中仍為探索階段，一般認(rèn)為：
    A. 一 次超出3SD；
    B. 連續(xù)二次超出2SD；
    C. 3～5次連續(xù)處于一側(cè)的2SD之內(nèi)；
    D. 5～7次連續(xù)偏向橫軸的一側(cè)，均為失控。目前多采用一次超過2SD作為“告警”，一次超出3SD為“失控”。
9. 總結(jié)
   

     酶聯(lián)免疫試劑盒測定方法是以抗原抗體間的特異反應(yīng)為基礎(chǔ)的，其與生化的化學(xué)反應(yīng)有著本質(zhì)的區(qū)別，酶聯(lián)免疫測定技術(shù)從低敏捷的免疫沉淀和免疫凝集反應(yīng)進入到了高敏捷的放射免疫、酶免疫、熒光免疫和發(fā)光免疫測定時代，可見酶聯(lián)免疫測定更多的是用于生物活性物質(zhì)的微量測定。